Antibodi monoklonal

Setelah sekian lama para ilmuwan mengeksplorasi imunoterapi kanker, akhirnya pada dekade terakhir (menjelang tahun 2000), produk berbasis antibodi di bidang onkologi mulai digunakan dalam tatalaksana berbagai macam kanker. Terapi antibodi monoklonal merupakan bentuk pasif dari imunoterapi (imunoterapi pasif), karena antibodi dibuat dalam kuantitas besar di luar tubuh. Jadi terapi ini tidak membutuhkan sistem imun pasien untuk bersikap aktif melawan kanker.

Antibodi diproduksi secara masal dalam laboratorium dengan menggabungkan sel myeloma (tipe kanker sumsum tulang) dari sel B mencit yang menghasilkan antibodi spesifik. Sel hasil penggabungan ini disebut hibridoma. Kombinasi sel B yang bisa mengenali antigen khusus dan sel myeloma yang hidup akan membuat sel hibridoma menjadi semacam pabrik produksi antibodi yang tidak ada habisnya. Karena semua antibodi yang dihasilkan identik, berasal dari satu (mono) sel hibridoma, mereka disebut antibodi monoklonal (disingkat MAb).

• Mono: Satu
• Klon: strain sel yang diturnkan dari satu sel.
• Antibodi monoklonal diproduksi dari fusi sel B dan sel myeloma membentuk hibridoma.
• Antibodi monoklonal hanya mengenal satu epitop.

Apa perbedaaan antibodi poliklonal dan monoklonal?

Antibodi poliklonal adalah di dalam suatu populasi antibodi terdapat lebih dari satu macam antibodi, atau campuran antibodi yang mengenal epitop yang berbeda pada antigen yang sama.

Proses yang terjadi pada antibodi poliklonal:

1. Diproduksi dengan imunisasi hewan dengan antigen yang tepat.
2. Serum dari hewan terimunisasi dikumpulkan
3. Antibodi dalam serum dapat dimurnikan lebih lanjut.
4. Karena satu antigen menginduksi produksi banyak antibodi maka hasilnya berupa ‘polyclonal’ /campuran antibodi.

Antibodi Monoklonal (MAb) adalah antibodi homogen yang dengan spesifitas yang sama diproduksi dari klon tungal dari sel yang menghailkan antibodi. Klon adalah segolongan sel yang berasal dari satu sel karena secara gentiknya identik.

Tahapan dalam produksi antibodi monoklonal:

1. Produksi dan seleksi hibridoma yang diharapkan
2. Amplifikasi mAb dari sel hibridoma terpilih melaui produksi ascites dan fermentasi melalui kultur sel
3. Purifikasi MAb, bisa menggunakan filtrasi, ultrasentrifugasi, dan kromatografi afinitas
4. Proses penambahan: disebut konjugasi
5. Formulasi dan sterilisasi

Produksi dan seleksi hibridoma

Sel memiliki dua jalur dalam sintesis nukleotida yaitu jalur de novo dan jalur salvage (penyelamatan). Sel yang dikultur in vitro bisa bertahan hidup menggunakan kedua jalur tersebut. Jika dilakukan mutasi pada enzim yang terkait sintesis nukleotida, maka kita bisa memanipulasi sel mamalia tersebut. HGPRT (Hipoxantin-guanin fosforibosil transferase) merupakan enzim penting dalam jalur salvage. HGPRT mengkatalis pembentukan nukleotida purin dari ribosa, hipoxantin, dan guanin.

Gambar 2.

Mutasi gen HGPRT bisa diseleksi dengan cara menumbuhkan sel di medium yang mengandung 8-azoguanin (analog purin). HGPRT akan menganggap 8-azoguanin adalah substrat dan selankutnya mengubahnya menjadi nukleotida monofosfat. Senyawa ini bersifat berbahaya, kemudian diproses lebih lanjut dan berikatan dengan DNA dan RNA. Sehingga, sel yang memiliki enzim HGPRT yang tumbuh pada medium yang mengandung 8-AG akan mati.

However, enzim HGPRT adalah diperlukan pada jalur salvage (non-esensial), sedangkan jalur de novo masih ada, jadi sel yang mengalami mutasi gen HGPRT pun tetap tumbuh. Oleh karena itu, seleksi menggunakan 8-AG akan membunuh sel yang memiliki HGPRT tetapi tidak akan berefek pada sel mutan HGPRT.

Apa hubungannya dengan produksi antibodi monoklonal? Sel myeloma yang nantinya akan difusikan dengan sel penghasil antibodi, tidak mensintesis atau mensekresikan imunoglobulin dan HGPRT. Untuk menyeleksi hibridoma yang cocok, bisa digunakan medium HAT. Obat-obatan seperti aminopterin akan mengeblok sintesis nukleotida jalur de novo karena aminopterin adalah analog dengan koenzim f-THFA/formyl tetrahidrofolic acid, yang penting untuk sintesis nukleotida purin via jalur de novo. Hal ini menyebabkan adanya pengeblokan pada jalur de novo karena kompetisi ikatan enzim dengan f-THFA. Sehingga sel akan dipaksa menggunakan jalur salvage untuk sintesis purin.

Namun, sel myeloma sendiri adalah defisiensi enzim HGPRT dan akan mati pada media yang mengandung aminopterin. Splenosit tidak bisa tumbuh pada medium HAT karena jangka hidupnya yang pendek sekitar satu minggu. Sehingga, hanya hibridoma yang merupakan fusi sel dari myeloma dengan splenosit saja yang bisa bertahan hidup pada medium HAT, induk splenosit akan menyumbangkan enzim HGPRTnya dan sel myeloma memberikan kemampuan untuk bisa hidup dan berkembang terus.

Dalam jangka waktu 7-10 hari, pada medium akan terdapat banyak sel-sel mati tetapi juga terdapat beberapa koloni sel  yang hidup, yaitu sel hibridoma. Hibridoma yang terbentuk ini akan terus menerus tumbuh secara in vitro dan mensekresikan antibodi monoklonal. Berikutnya, penting untuk skrining hibridoma mana yang menghasilkan antibodi dan mana yang tidak. Skrining ini bisa menggunakan metode ELISA.

Gambar 3.

Apakah tujuan penggunaan antibodi monoklonal? Antibodi monoklonal dapat digunakan untuk tiga tujuan berikut:

1. pemurnian reagen untuk tes atau penelitian

2. sebagai penanda pada deteksi assay

3. untuk eksperimental terapi

Aplikasi terapi dari Antibodi monoklonal

1. Induksi imunisasi pasif
2. Diagnostik imaging. Antibodi monoklonal dapat digunakan untuk melihat protein tertentu dalam tubuh, misal antibodi monoklonal dikonjugasikan dengan logam inert pasien yang dirontgen. Dari hasil rontgen tersebut dapat dikenali protein tertentu yang terlibat dalam penyakit. Cara ini  juga diterapkan dalam melihat metastasis sel kanker.
3. Diagnostik molekular. Antibodi monoklonal dapat diaplikasikan untuk identifikasi penyakit yang lebih dikenal dengan imunologikal diagnostik. Di mana deteksi imunologik merupakan deteksi imunologik merupakan sistem deteksi yang sensitif, spesifik, dan sederhana. Misal: membedakan DHF dan tifus.
4. Monitoring terapi obat (untuk live-saving drug)
5. Sistem penghantaran obat (Drug delivery system/DDS)
6. Isolasi dan atau purifikasi obat baru
7. Terapi kanker.Para ahli bisa membuat antibodi monoklonal yang mampu bereaksi dengan antigen spesifik berbagai jenis sel kanker. Dengan ditemukannya lebih banyak lagi antigen kanker, berarti akan semakin banyak antibodi monoklonal yang bisa digunakan untuk terapi berbagai jenis kanker.Bila antibodi berikatan dengan antigen tumor spesifik yang terdapat di permukaan sel, maka ia juga bisa menginduksi sel mengalami apoptosis. Misal, rituximab mengikat dua molekul CD20, maka akan memicu sinyal masuk kedalam sel yang akan menginduksi apoptosis. Bila rituximab berikatan silang dengan antiantibodi, maka sinyal apoptotik diintensifkan. Ikatan silang ini juga bisa terjadi bila antibodi terikat dengan sel imun lainnya melalui rerseptor Fc-gamma (Fc R).

Toksin yang biasa dikonjugasikan dengan antibodi monoklonal persiapan untuk penggunaan klinik sebagai agen antikanker:

1. ricin
2. pokeweed
3. gelonin
4. Pseudomonas endotoksin
5. Diptheria toksin
6. abrin
7. protein antiviral

Antibodi Monoklonal Generasi Baru

Terapi menggunakan antibodi monoklonal terganggu dengan munculnya beberapa masalah. Pada eksperimen awal, terdapat reaksi alergi dari bagian asing antibodi eksperimental dari tikus yang disebut HAMA (human anti-mouse antibody) yang mencegah digunakan lebih dari sekali. Para ahli mengatasi masalah ini dengan membuang bagian antigen dari bagian tikus tersebut, dengan membuat antibodi chimeric dan humanized mAB.

Chimeric mAb

Rituximab adalah antibodi monoklonal pertama yang termasuk dalam chimeric mAb. Chimera diambil dari nama sebuah hewan mistis. Rituximab dibuat dari fusi dua sel dari mencit dan manusia.

Humanized mAb

Antibodi monoklonal dalam bidang onkologi:

Rituxan,  Herceptin, Campath, Zevalin tiuxetan, Mylotarg are full prescribing Information

Antibodi monoklonal pada B-Cell Lymphomas

• Rituximab:  Naked chimeric monoclonal antibody against CD20 antigen
• CD20 on cell surface of most B-cell malignancies except primitive B-cell ALL and post-mature myeloma cells

Key features of Rituximab

• Chimeric anti-CD20 MoAb
• Activates complement mediated cytotoxicity & Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC)
• Mempunyai efek anti-tumor langsung
• Aktivitas sinergis dengan kemoterapi
• Sensitises chemoresistant cell lines

Chimeric dan humanized antibodi (dibandingkan dengan murine Ab)

1. Menurunkan tingkat imunogenitas secara signifikan (80% à 5%)
2. Waktu paruh di serum yang lebih lama (14-23 hari dibandingkan dengan 30-40 jam), sehingga frekuensi pemberian bisa dikurangi
3. Allow activation of various Fc-mediated functions eg. Activation of complement

Penutup

Full Prescribing

rituxan-prescribing

herceptin-prescribing

Campath

Zevalin_PI_Website

herceptin.doc

DNA Fingerprinting.doc

RESEPTOR TIROSIN KINASE

• Drug and Disease
• Immunology