Tips sukses double digestion

Double digestion sangat umum ditemui dalam konstrak DNA. Bisa mudah kita bayangkan kita mau potong insert atau vektor, enzim restriksi ini adalah guntingnya. Untuk bekerja optimal (100%), maka diperlukan kondisi tertentu yang disediakan oleh buffer tertentu pula. Double digestion akan jadi mudah kalau buffer dari 2 enzim yang digunakan adalah sama. Nah, kalau beda, ini kudu mikir.

Secara umum, ada 3 jenis buffer universal yaitu L buffer, M buffer, dan H buffer. Untungnya, Toyobo menyediakan tabel ini, yaitu daftar enzim dan buffer mana yang digunakan untuk menghasilkan kerja efisiensi 100%.

Perhatikan, ada kode ABCD yang menunjukkan efisiensi pemotongan pada buffer tertentu (LMH). Dan biasanya buffer yang disediakan oleh pabrik yaitu 10X sehingga komponennya cukup dikali 10 dari yang tertulis di atas

L bufer misalnya menjadi:

• 100 mM Tris-HCl (pH7.5)
• 100 mM MgCl2
• 10 mM Dithiothreitol (DTT)

H buffer menjadi:

• 500 mM Tris－HCl (pH 7.5)
• 100 mM MgCl2
• 1000 mM NaCl
• 10 mM DTT

Sekarang kita masuk ke kasus nyata, dimana saya mau potong DNA pakai ApaI dan BamHI. Di label, ApaI pakai L buffer, sedangkan BamHI pakai H buffer.

Cara potongnya:

• Selalu mulai dari yang komponen buffernya L, terus M, dan H. Sehingga kali ini saya potong pertama kali adalah dengan ApaI. Potong selama 1 jam, kemudian dilanjut potong pakai BamHI.
• Coba perhatikan komponen buffernya. L dan H buffer berbeda pada konsentrasi Tris-HCl dan NaCl-nya, sedangkan lainnya sama. Sehingga pada pemotongan kedua yang pakai BamHI, saya ga perlu pakai H buffer, tapi cukup adjust dari komponen yang kurang dengan stok Tris-HCl dan NaCl konsentrasi tinggi yang ada di lab.

Adjust yang saya lakukan saat BamHI:

• Volume total = 10 uL
• L-Buffer 1 uL
• Tris HCl = 0.5 uL (stock 1 M)
• NaCl = 0.4 uL (stock 2.5 M)

 

Resume komposisi reaksi

Komposisi reaksi yang saya lakukan untuk ApaI:

• DNA = 5.5 uL (stock 116.5 ng)
• Nuclease free water = 3.2 uL
• Enzyme ApaI = 0.3 uL
• L buffer = 1 uL

37 derajat 1 jam

• Lanjut BamHI dengan adjust di atas.

37 derajat 1 jam

================

Plasmid contain 6 T:

• DNA 0.8 uL
• Nuclease free water = 7.9 uL
• Enzyme ApaI = 0.3 uL
• L buffer = 1 uL

Star activity

Tau kan ini? Ini artinya pemotongan tidak spesifik yang bisa dikarenakan oleh beberapa hal. Misal untuk BamHI diperngaruhi oleh:

• konsentrasi garam yang rendah
• kelebihan enzim
• konsentrasi tinggi gliserol
• adanya Mn2+

 

Website penting: Protein !!

Pengen tahu berat molekul protein berdasarkan asam amino?

• ExPASy

Pengen analisis signal peptida?

• UniProt
• SignalP 4.1
• PrediSi

Pengen gambar plasmid?

• savvy

Pengen tau gambar plasmid CMV5?

• Addgene

Mau ngitung Tm primer?

• Oligo Calculator

Bagaimana membuat BSA 1 persen?

Sebelum menjawab pertanyaan di atas, perlu diketahui dulu nih apa itu BSA dan serba-serbinya.

Apakah BSA?

Kata bovine berarti “sapi,” dan albumin serum sapi (bovine serum albumin, BSA) adalah protein yang berasal dari sapi. Secara khusus, BSA adalah sejenis protein yang disebut albumin, yang ditemukan dalam jumlah besar dalam darah sapi.

Darah adalah campuran sel darah merah, itulah sebabnya darah terlihat merah, dan berbagai jenis protein yang larut dalam air. Jika sel-sel dalam darah dikeluarkan, Anda akan temukam cairan bening, yang disebut serum.

Jadi, BSA adalah protein albumin yang ditemukan dalam darah sapi. Di dalam darah, tugas albumin adalah membawa protein lain dari satu tempat ke tempat lain.

Apakah larutan 1%?

Kata “larutan” menggambarkan sesuatu yang ada sebagai cairan. Ketika kita mengatakan bahwa larutan 1% gula, itu berarti bahwa 1% molekul dalam larutan tersebut adalah molekul gula, sementara 99% lainnya adalah molekul air.

Dengan demikian, larutan BSA 1% berarti bahwa 1% molekul dalam larutan tersebut adalah BSA. Karena BSA sering dijual sebagai serbuk kering, sejumlah itu perlu ditimbang dan kemudian dilarutkan dalam cairan, seperti air.

Melarutkan serbuk BSA ke dalam cairan disebut pengenceran berat-per-volume, sering ditulis sebagai “w/v” (weight/volume) dalam petunjuk yang menyertai bahan kimia atau percobaan ilmiah.

Timbanglah secara akurat

Serbuk BSA sangat ringan dan sering digunakan dalam jumlah kecil, jadi peneliti memerlukan skala timbangan yang sangat sensitif untuk mengukur BSA secara akurat.

Peneliti sering tidak memerlukan sejumlah besar larutan BSA, sehingga membuat beberapa galon atau liter sekaligus akan menjadi sia-sia dan menyita ruang penyimpanan.

Eksperimen biokimia dan biologi molekular sering menggunakan sejumlah kecil larutan BSA, dan umumnya praktik yang baik untuk membuatnya segar setiap saat.

Cara sederhana untuk membuat larutan BSA 1% adalah dengan menimbang satu gram bubuk BSA, tuangkan ke dalam silinder berskala yang bisa menampung lebih dari 100 mililiter (mL) air, lalu tambahkan air sampai mencapai tanda 100 mL. Secara matematis, satu dibagi dengan 100 sama dengan 1%.

Memilih pelarut yang tepat untuk melarutkan serbuk BSA

Tidak semua eksperimen mengharuskan BSA dilarutkan dalam air, karena air murni memiliki sifat yang berbeda dari cairan yang mengalir dalam aliran darah hewan dan cairan sekitar di luar sel.

Cairan di dalam hewan memiliki sejumlah garam dan asam tertentu, jadi jika tujuan larutan BSA membawa obat yang akan disuntikkan ke hewan hidup, serbuk BSA harus dilarutkan dalam cairan khusus.

Cairan umum yang digunakan untuk tujuan percobaan adalah phosphate buffer saline (PBS). PBS memiliki sifat yang serupa dengan cairan di dalam organisme hidup seperti tikus, anjing dan manusia, sehingga dapat digunakan untuk melarutkan BSA dan bahan kimia lainnya.

Referensi

https://sciencing.com/make-one-percent-bsa-solution-8623641.html

Konsep dasar Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase chain reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase adalah teknik yang digunakan di laboratorium untuk membuat jutaan salinan bagian tertentu dari DNA. Teknik ini pertama kali dikembangkan pada 1983 oleh ahli biokimia Amerika, Kary Mullis. Dia dianugerahi Penghargaan Nobel dalam bidang Kimia pada tahun 1993 untuk karya rintisannya.

PCR adalah alat yang biasa digunakan di laboratorium penelitian medis dan biologi. Hal ini digunakan pada tahap awal pengolahan DNA untuk sequencing (penentuan urutan DNA), untuk mendeteksi ada atau tidak adanya gen untuk membantu mengidentifikasi patogen selama infeksi, dan saat membuat profil DNA forensik dari sampel kecil DNA.

PCR digunakan dalam biologi molekuler untuk membuat banyak salinan (amplify, memperkuat) bagian kecil dari DNA atau gen. Dengan PCR memungkinkan untuk menghasilkan ribuan sampai jutaan salinan bagian tertentu dari DNA dari jumlah yang sangat kecil dari DNA.

Bagaimana prinsip kerja PCR?

Lima bahan inti yang diperlukan untuk menjalankan PCR:

1. template DNA yang akan disalin
2. primer, potongan pendek DNA yang memulai reaksi PCR, yang dirancang untuk mengikat kedua sisi bagian dari DNA yang ingin disalin
3. basa DNA nukleotida (juga dikenal sebagai dNTP). Basa DNA (A, C, G dan T) adalah bahan baku bangunan DNA dan diperlukan untuk membangun untai baru DNA
4. enzim polimerase Taq, untuk menambahkan dalam basa DNA baru
5. larutan penyangga, untuk memastikan kondisi yang tepat untuk berjalannya reaksi.

Prinsip PCR (sumber: microbiologyinfo)

PCR melibatkan proses pemanasan dan pendinginan yang disebut siklus termal yang dilakukan oleh mesin. Ada tiga tahap utama yaitu:

1. Denaturasi – ketika template DNA untai ganda dipanaskan untuk memisahkan menjadi dua untai tunggal.
2. Annealing – ketika suhu diturunkan untuk mengaktifkan primer DNA untuk menempel ke DNA template.
3. Extending/elongation – ketika suhu dinaikkan dan untai baru DNA dibuat oleh enzim polimerase Taq.

Ketiga tahap diulang 20-40 kali (cycles, siklus), dihasilkan jumlah salinan sebanyak dua kali lipat setiap kali siklus. Reaksi PCR lengkap dapat dilakukan dalam beberapa jam, atau bahkan kurang dari satu jam dengan mesin kecepatan tinggi tertentu. Setelah PCR telah selesai, metode yang disebut elektroforesis dapat digunakan untuk memeriksa kuantitas dan ukuran fragmen DNA yang dihasilkan.

Apa yang terjadi pada setiap tahap PCR?

Tahap denaturasi

• Selama tahap ini, campuran yang mengandung DNA template dan semua bahan inti lainnya dipanaskan untuk 94-95⁰C.
• Suhu tinggi menyebabkan ikatan hidrogen antara basa di dua untai DNA template akan putus dan terpisah menjadi dua helai.
• Hal ini menyebabkan dua untai tunggal DNA, yang akan bertindak sebagai template untuk produksi untai baru DNA.
• Penting bahwa suhu dipertahankan pada tahap ini cukup lama untuk memastikan bahwa untai DNA telah dipisahkan sepenuhnya.
• Tahap ini biasanya membutuhkan waktu antara 15-30 detik.

Tahap annealing

• Selama tahap ini reaksi didinginkan sampai 50-65⁰C. Hal ini memungkinkan primer untuk menempel ke lokasi tertentu pada DNA template untai tunggal dengan cara ikatan hidrogen (suhu yang tepat tergantung pada suhu leleh primer (Tm, melting point) yang digunakan).
• Primer adalah untaian tunggal DNA atau RNA dengan panjang sekitar 20 sampai 30 nukleotida.
• Primer dirancang untuk menjadi pelengkap di urutan pendek DNA pada setiap akhir urutan yang akan disalin.
• Primer berfungsi sebagai titik awal untuk sintesis DNA. Enzim polimerase hanya dapat menambahkan basa DNA untuk untai ganda DNA. Oleh karena itu, enzim bisa bekerja setelah primer menempel dan komplemen pada DNA template dan memulai membuat DNA baru.
• Dua helai DNA yang terpisah adalah saling melengkapi dan berjalan dalam arah yang berlawanan (dari ujung 5′ dan ujung 3′); oleh karena itu, digunakan dua buah primer yaitu primer maju (forward) dan primer terbalik (reversed).
• Langkah ini biasanya membutuhkan waktu sekitar 10-30 detik.

Tahap extending/elongation

• Selama langkah terakhir ini, panas meningkat menjadi 72⁰C untuk mengaktifkan DNA baru yang akan dibuat oleh enzim DNA polimerase Taq yang menambahkan basa DNA.
• Enzim Taq DNA polymerase adalah enzim yang diambil dari bakteri tahan panas-Thermus aquaticus. Bakteri ini biasanya hidup di sumber air panas sehingga dapat mentolerir suhu di atas 80⁰C. DNA polimerase pada bakteri ini sangat stabil pada suhu tinggi, yang berarti dapat menahan suhu yang diperlukan untuk memecahkan untaian DNA terpisah dalam tahap denaturasi dari PCR.
  DNA polimerase dari kebanyakan organisme lain tidak akan mampu menahan suhu tinggi, misalnya, polimerase manusia bekerja idealnya di 37 oC (suhu tubuh).
• Suhu 72⁰C adalah suhu optimum untuk Taq polimerase untuk membangun untai komplementer. Enzim menempel ke primer dan kemudian menambahkan basa DNA ke untai tunggal satu-per-satu pada arah 5’ ke 3’.
• Hasilnya adalah pita untai baru DNA dan molekul untai ganda DNA.
• Durasi tahap ini tergantung pada panjang urutan DNA yang diperkuat tetapi biasanya memakan waktu sekitar satu menit untuk menyalin 1.000 basa DNA (1kb).

Ketiga proses siklus termal diulang 20-40 kali untuk menghasilkan banyak salinan dari urutan DNA yang diinginkan. Perlu diketahui bahwa fragmen baru DNA yang dihasilkan selama PCR juga berfungsi sebagai template bagi enzim DNA polimerase sehingga dapat menempelkan dan mulai membuat DNA. Hasilnya adalah sejumlah besar salinan segmen DNA spesifik yang dihasilkan dalam waktu yang relatif singkat.

Referensi

What is CR (polymerase chain reaction), yourgenome.org, diakses tanggal 11 April 2017

Tips qPCR

Setelah design primer (di sini postingannya), sekarang saatnya running PCR-nya. Bagaimana tips-tipsnya?

1. Jangan lupa nulis di log book kalo pakai mesin, nanti dibuang ma cikgu kecil kalo sampe lupa nulis (15.12.18).
2. Konsentrasi cDNA harus cukup, minimal 400 ng. Jangan kurang dari itu, kalo kurang maka Cq dari GAPDH bakal tinggi banget (16.01.25)

Tips ekstraksi RNA (RNA prep) (16.01.30)

1. Bereskan meja kerja, singkirkan barang2 tidak terpakai. Lalu semprot pakai alkohol 75% dan lap tisue.
2. Setelah itu semprot pakai RNase Quiet, semua pipet yang mau dipakai juga disemprot pakai cairan ini.
3. Pakai gloves (dan masker serta jas leb kalo ada).
4. Jangan ngomong ketika kerja karena ludahmu mengandung RNase.
5. Kumpulkan semua bahan yang diperlukan: sepasol, isopropanol, kloroform, etanol 99%. DEPC water.
6. Ambil es pakai wadah setroform.
7. Siapkan microtube baru, blue tip dan yellow tip baru (dari kemasan), bukan hasil autoclave. Tandai mikrotube pakai spidol (2 seri: pertama untuk transfer sel dari well, kedua dipakai setelah sel disentrifugasi).
8. Jangan pergi2 ke ruang lain karena gagang pintu banyak RNase, atau ngetik di komputer ato hape, banyak RNase-nya.
9. Ganti gloves pada tahap ini.
10. Buat etanol 85% dengan melarutkan etanol 99% + DEPC water (total 30 mL, sebagai contoh).
11. Sudah siap semua, baru ambil sel dari inkubator.
12. Aspirate medium, ga usah dicuci biar sel nya ga katut.
13. Tambah sepasol 1 ml, lalu goyang2 pake alat yang biasa buat goyang Western Blot, 5 menit.
14. Resuspensi sel sebelum ditransfer ke tube, untuk meyakinkan sel-sel benar lepas.
15. Transfer sel ke tube. Tambah kloroform 200 uL lalu gojog kuat.
16. Diamkan 3 menit RT
17. Sentrifugasi 12000 g, 15 menit, 4 derajat.
18. Ambil supernatan 500 uL, pindah ke tube baru (sudah disiapkan di step no 7).
19. Tambah isopropanol equal volume (500 uL). Gojog kuat. Masukkan ke es 10 menit.
20. Sentrifugasi 15000 rpm, 15 menit, 4 derajat.
21. Buang supernatan, jangan bersih2 amat nyedotnya, sisain 2-4 mm cairan (biasanya pellet ga keliatan).
22. Tambah etanol 85% (yang udah dibuat di step 10) 1 ml. (Kenapa pake 85% ga 75%? Biar airnya dikit, kalo kebanyakan air RNA-nya bisa larut).
23. Gojog kuat gpp
24. Sentrifugasi lagi 12000 g, 5 menit, 4 derajat.
25. Sedot cairan, sisain 2-4 mm cairan.
26. Lalu masukkan ke sentrifugator vacum, biar etanolnya menguap, selama 5 menit.
27. Ada sedikit cairan tersisa, gpp itu air. Lalu tambah DEPC water 20 uL.
28. Ukur pake nano-drop.
29. Dan saya kaget, dengan cara ini hasilnya 1500an, dengan A260/280 di atas 1,8. Kemarin pake cara yang ga hati2, dapetnya 89. Naik signifikan. Alhamdulillah. Kerja RNA ini memang bikin deg-degan, baca sholawat di depan nano drop ngeliatin pita, bikin deg-degan kayak nunggu pengumuman UMPTN.

Terima kasih kepada teman Jepang, yang telah berbagi pengalamannya.

Cara desain primer untuk PCR

Apa itu primer?

Primer adalah komponen penting kalau ingin eksperimen pakai PCR. PCR itu metode meniru dari proses replikasi. Seperti yang kita tahu, saat replikasi butuh sekuen pendek berupa RNA yang nantinya enzim DNA polimerase akan memperpanjang rantai DNA bari. Nah, sekuen pendek inilah yang dinamakan primer. Tidak hanya di sel, proses PCR juga butuh primer lho.

Mendesain primer

Mendesain primer merupakan langkah penting untuk kesuksesan PCR. Kalau primernya bagus, maka amplifikasinya bagus, dan hasil sesuai harapan. Tapi kalau primer tidak spesifik, nempel dimana-mana, dan hasilnya juga jelek. Ketika mendesain primer, kita akan bikin dua buah primer tiap gen targetnya yaitu primer forward dan primer reversed.

Pakai software apa?

Banyak sekali pilihan software (online, download) yang bisa dipakai, misal BLAST. Tapi saya hampir selalu pake primer3. Tidak ada alasan khusus, karena diajari sama sensei pake yang ini, belum pernah nyoba yang lain. Primer3 ini gratis, pas nyari di Google bakal banyak pilihan primer3. Nah, setelah saya coba-coba, situs ini yang paling oke, hasilnya reprodusibel dan mudah (tidak perlu gonti-ganti parameter lagi settingannya, ikut settingan awal). Situsnya: LINK.

Bagaimana caranya?

1. Buka NCBI di sini [Link]
2. Pilih Gene lalu masukkan gen yang dimaksud (+ human), misalnya fibronectin human
3. Pilih yang paling atas, pilihs FN1 ID: 2335
4. Cari see related, Ensembl
5. Di halaman Ensembl, cari bp terpanjang (dalam hal ini baris 1), lalu klik RefSeq NM…
6. Muncul halaman Nucleotida, sorot bagian exon, CDS, dan Origin.
7. Nucleotida yang sudah dipilih, petanya ada di gambar 4. Pilih exon yang jarak intron-nya jauh tapi masih masuk dalam CDS. Dalam hal ini misal ekson EE13-14 dan E20-21.
8. Masih di halaman Gambar point 6, lihat info CDS, ekson 13, 14, 20, 21. Didapat data ini:

CDS: 267-7700

E13: 2087-2207, E14: 2208-2388

E20: 3253-3519, E21: 3520-3614

Data ini sudah lengkap, mari kita masuk ke situs Primer3 untuk mulai desain primer (kita akan buat 2 primer untuk 1 gen). Sekuen yang dikopi ke Primer3 adalah Origin.

Desain Primer

1. Buka situsnya di sini: Primer3Plus
2. Paste Origin ke kolom, lalu set parameter di halaman General Setting (bisa pakai angka-angka di bawah)
3. Isi nomor sekuen ekson kedua, misal E13 yaitu 2207 . Lalu koma 2 (akan dicari 2 nukleotida unik). Jadi ditulis target ini adalah 2207,2
4. Lalu klik Pick Primer. Diperoleh primer F dan R. Kopi ke Ms Excell. Lakukan hal yang sama untuk desain primer kedua menggunakan E20 dan 21.

 

Semoga bermanfaat. Jika ada yang belum jelas, diskusi dibuka lebar.

Salam

 

PCR-SSCP untuk deteksi mutasi BRCA

DETEKSI MUTASI BRCA-1 DENGAN PCR-SSCP HETERODUPLEKS

Dibahas oleh: Sarmoko

BRCA adalah tumor supprosor gene yang bertanggung jawab pada repair kerusakan DNA. JIka terjadi mutasi, maka proses repair tidak berjalan sehingga muncul ketidakstabilan genome dan timbullah kanker. Wanita dengan mutasi BRCA memiliki risiko seumur hidup kumulatif terhadap kanker payudara invasif sekitar 55-85%. Jadi ketersediaan analisis BRCA membawa dampak yang penting untuk treatment dan konseling bagi perempuan yang ber-risiko. Analisis gen BRCA1 dan BRCA2 memungkinkan untuk mengidentifikasi mutasi predisposisi pada orang yang terkena dampak dan menentukan risiko untuk anggota keluarga. Setelah mutasi diidentifikasi, anggota keluarga tanpa gejala dapat diuji untuk mutasi, karena keluarga dekat bisa memiliki risiko terkena penyakit ini.

Isolasi DNA plasmid

Many types of bacteria contain plasmid DNA. Plasmids are extra-chromosomal, double-stranded circular DNA molecules generally containing 1,000 to 100,000 base pairs. Even the largest plasmids are considerably smaller than the chromosomal DNA of the bacterium, which can contain several million base pairs. Certain plasmids replicate independently of the chromosomal DNA and can be present in hundreds of copies per cell.

Pengecatan hematoksilin – eosin (HE)

Pengecatan HE telah digunakan setidaknya selama satu abad dan sampai sekarang masih digunakan untuk mengenali berbagai jenis jaringan dan perubahan morfologi yang membentuk dasar diagnosis kanker. Pewarnaan telah berubah selama bertahun-tahun karena bekerja dengan baik dengan berbagai fiksasi dan menampilkan berbagai sitoplasma, fitur matriks inti, dan ekstraseluler.

Hematoksilin berwarna biru-ungu tua dan mewarnai asam nukleat oleh reaksi kompleks yang tidak sepenuhnya dipahami. Eosin berwarna merah muda dan mewarna protein nonspesifik. Dalam jaringan yang khas, inti berwarna biru, sedangkan sitoplasma dan matriks ekstraseluler (ECM) memiliki berbagai tingkat pewarnaan merah muda.

Inti menunjukkan variasi sel-jenis-dan kanker tipe tertentu pola kondensasi heterokromatin (pewarnaan hematoksilin) yang sangat penting dalam diagnosa. Nukleolus diwarnai oleh eosin.

Jika terdapat banyak poliribosom, sitoplasma akan memiliki inti biru yang berbeda. Zona Golgi dapat diidentifikasi sementara dengan tidak adanya pewarnaan di daerah sebelah inti. Dengan demikian, pewarnaan mengungkapkan informasi struktural yang melimpah, dengan implikasi fungsional tertentu.

Keterbatasan pewarnaan hematoksilin yaitu teknik ini tidak sesuai dengan imunofluoresensi. Hal ini berguna, namun untuk warna satu bagian parafin serial dari suatu jaringan yang mana imunofluoresensi akan dilakukan.

Hematoksilin, umumnya tanpa eosin, berguna sebagai counterstain untuk prosedur imunohistokimia atau hibridisasi yang menggunakan substrat kolorimetri (seperti alkali fosfatase peroksidase).

Referensi

CSHProtocol

Protokol online

Pemisahan protein dengan SDS-PAGE

Protein merupakan molekul dengan tingkat kompleksitas atau kerumitan yang cukup tinggi. Protein memiliki perbedaan satu sama lain karena muatan listriknya berbeda, protein juga berbeda karena berat molekul atau asam amino penyusunnya.

Berdasarkan perbedan berat atau ukuran molekul ini, protein dapat dipisahkan satu sama lain dengan teknik elektroforesis. Teknik elektroforesis paling terkenal menggunakan gel poliakrilamid sebagai media pemisah.

Preparasi sampel

Mula-mula, protein didenaturasi dengan pemanasan larutan dapar yang mengandung sodium dodesil sulfat (SDS). Denaturasi dalam SDS panas akan memberikan muatan negatif pada seluruh protein dalam larutan, karena terjadi interaksi hidrofobik antara molekul protein dengan protein SDS.

Interaksi ini sebanding dengan ukuran molekul suatu protein. Jadi, makin besar ukuran molekul suatu protein, makin banyak muatan negatif hasil interaksi protein dengan SDS.

Selanjutnya bila diberi medan listrik, kompleks protein yang terdenaturasi SDS di dalam gel poliakrilamid akan berjalan ke satu arah, yaitu kutub positif (anoda).

Jarak yang ditempuh ditentukan oleh ukuran molekul dalam menembus pori-pori gel. Makin kecil molekul tersebut, makin jauh jarak yang ditempuh. Dengan demikian, terjadilah pemisahan protein berdasarkan berat molekul.

Pembuatan gel

Gel poliakrilamid dibentuk oleh polimerisasi akrilamid (CH2=CH-CO-NH2) dan bisakrilamid (N,N’-metilenbisakrilamid)(CH2=CH-CO-NH2-CH2-NH-CO-CH=CH2). Proses pembentukan polimer ini diawali oleh suatu sistem yang menghasilkan radikal bebas.

Umumnya, polimerisasi diawali dengan penambahan ammonium persulfat (APS) sebagai inisiator, dan tetrametilendiamin (TEMED) sebagai akselerator. Pada proses ini, TEMED mempercepat pemecahan molekul APS menjadi sulfat radikal bebas, yang selanjutnya akan mengawali  reaksi polimerisasi akrilamid dan bisakrilamid.

Tanpa adanya bisakrilamid akan terbentuk rantai polimerisasi akrilamid yang panjang, yang menghasilkan larutan kental namun bukan gel. Dengan penambahan bisakrilamid, pada rantai akrilamid tersebut akan terbentuk ikatan saling silang (cross-link) pada jarak tertentu sehingga terbentuk suatu jaringan dengan besar pori tertentu.

Konsentrasi akrilamid menentukan ukuran pori-pori gel yang terbentuk sehingga ukuran pori dapat diatur dengan mengatur konsentrasi akrilamid. Makin rendah konsentrasi akrilamid yang digunakan, makin besar ukuran pori-pori gel, namun gel menjadi lunak dan mudah patah.

Sistem dapar atau buffer

Sistem dapar yang digunakan pada elektroforesis protein dengan gel poliakrilamid-SDS adalah sistem dapar diskontinu. Sistem ini menggunakan ion dapar yang berbeda dalam gel dan larutan dapar elektroda.

Keunggulan sistem ini adalah pemisahan protein berlangsung lebih baik dan lebih tajam. Gel yang digunakan pada system ini terdiri dari gel penumpuk (stacking gel) yang berpori besar dan gel pemisah (separating/resolving gel) yang berpori kecil. Gel penumpuk berada di atas gel pemisah dan sampel diletakan di atas gel penumpuk.

Molekul sampel yang melewati gel penumpuk, dengan cepat akan ‘tertumpuk’ dalam suatu zona yang sangat sempit (stacks). Sampel yang tertumpuk itu bergerak sepanjang gel penumpuk yang berpori besar dan kemudian masuk ke gel pemisah berpori kecil sebagai suatu pita yang tipis. Setelah memasuki gel pemisah, molekul sampel terpisah berdasarkan muatan dan ukuran.

Mekanisme pemisahan

Pemisahan protein dengan elektroforesis gel poliakrilamid terjadi berdasarkan perbedaan ukuran molekul. Untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekul dapat dilakukan dengan penambahan suatu detergen ionik dan menambahkan denaturasi. Pada proses persiapan sampel ditambahkan suatu detergen ionik sodium dodesil sulfat (SDS).

SDS akan menghilangkan perbedaan muatan dan perbedaan konformasi di antara protein-protein tersebut, dengan cara memberi muatan negatif. Agar seluruh rantai polipeptida terpapar pada detergen ionik dilakukan pemanasan pada suhu 95 oC selama 2-5 menit, dengan cara ini sebagian besar polipeptida akan diselubungi oleh SDS dengan rasio tertentu.

Analisa hasil

Kompleks SDS-polipeptida berbentuk seperti batang dan bermuatan negatif, dan muatan ini tidak dipengaruhi oleh pH pada kisaran pH 7-10. Dengan demikian, migrasi polipeptida dalam gel poliakrilamid adalah berdasarkan berat molekulnya. Kecepatan migrasi protein selama elektroforesis akan berbanding terbalik dengan berat molekulnya. Makin besar molekul, makin lambat migrasinya.

Referensi