Cara desain primer untuk PCR

Apa itu primer?

Primer adalah komponen penting kalau ingin eksperimen pakai PCR. PCR itu metode meniru dari proses replikasi. Seperti yang kita tahu, saat replikasi butuh sekuen pendek berupa RNA yang nantinya enzim DNA polimerase akan memperpanjang rantai DNA bari. Nah, sekuen pendek inilah yang dinamakan primer. Tidak hanya di sel, proses PCR juga butuh primer lho.

Mendesain primer

Mendesain primer merupakan langkah penting untuk kesuksesan PCR. Kalau primernya bagus, maka amplifikasinya bagus, dan hasil sesuai harapan. Tapi kalau primer tidak spesifik, nempel dimana-mana, dan hasilnya juga jelek. Ketika mendesain primer, kita akan bikin dua buah primer tiap gen targetnya yaitu primer forward dan primer reversed.

Pakai software apa?

Banyak sekali pilihan software (online, download) yang bisa dipakai, misal BLAST. Tapi saya hampir selalu pake primer3. Tidak ada alasan khusus, karena diajari sama sensei pake yang ini, belum pernah nyoba yang lain. Primer3 ini gratis, pas nyari di Google bakal banyak pilihan primer3. Nah, setelah saya coba-coba, situs ini yang paling oke, hasilnya reprodusibel dan mudah (tidak perlu gonti-ganti parameter lagi settingannya, ikut settingan awal). Situsnya: LINK.

Bagaimana caranya?

1. Buka NCBI di sini [Link]
2. Pilih Gene lalu masukkan gen yang dimaksud (+ human), misalnya fibronectin human
3. Pilih yang paling atas, pilihs FN1 ID: 2335
4. Cari see related, Ensembl
5. Di halaman Ensembl, cari bp terpanjang (dalam hal ini baris 1), lalu klik RefSeq NM…
6. Muncul halaman Nucleotida, sorot bagian exon, CDS, dan Origin.
7. Nucleotida yang sudah dipilih, petanya ada di gambar 4. Pilih exon yang jarak intron-nya jauh tapi masih masuk dalam CDS. Dalam hal ini misal ekson EE13-14 dan E20-21.
8. Masih di halaman Gambar point 6, lihat info CDS, ekson 13, 14, 20, 21. Didapat data ini:

CDS: 267-7700

E13: 2087-2207, E14: 2208-2388

E20: 3253-3519, E21: 3520-3614

Data ini sudah lengkap, mari kita masuk ke situs Primer3 untuk mulai desain primer (kita akan buat 2 primer untuk 1 gen). Sekuen yang dikopi ke Primer3 adalah Origin.

Desain Primer

1. Buka situsnya di sini: Primer3Plus
2. Paste Origin ke kolom, lalu set parameter di halaman General Setting (bisa pakai angka-angka di bawah)
3. Isi nomor sekuen ekson kedua, misal E13 yaitu 2207 . Lalu koma 2 (akan dicari 2 nukleotida unik). Jadi ditulis target ini adalah 2207,2
4. Lalu klik Pick Primer. Diperoleh primer F dan R. Kopi ke Ms Excell. Lakukan hal yang sama untuk desain primer kedua menggunakan E20 dan 21.

 

Semoga bermanfaat. Jika ada yang belum jelas, diskusi dibuka lebar.

Salam

 

• Methods